Игра продолжается вскоре после событий Assassin′s Creed, где, в 2012 году, Дезмонду Майлсу — пленнику «Абстерго Индастриз», которого используют для дешифрования его генетической памяти о его предке ассасине Альтаире в машине «Анимус», — грозит смертельная опасность. «Абстерго Индастриз», общественное ″лицо″ Ордена Тамплиеров, использовали Дезмонда, чтобы определить местонахождение мощного артефакта, именуемого «Частицей Эдема», или «Яблоком Эдема». Используя Орлиное Зрение, полученное в результате «эффекта просачивания» (из-за частого нахождения в Анимусе), Дезмонд видит сообщения и символы, написанные кровью на стене его спальни и в лаборатории предыдущим испытуемым, именуемым Объект 16. Люси Стиллман, сотрудник Абстерго и член Братства Ассасинов, освобождает Дезмонда и прячет его в секретном укрытии с двумя другими ассасинами, Шоном Гастингсом и Ребеккой Крэйн, создавшими улучшенную версию Анимуса. Они предлагают Дезмонду использовать генетическую память о его предке, Эцио Аудиторе